Test Western Blot – na czym polega? Analizujemy

Test Western Blot, znany również jako immunoblot, to szeroko stosowana technika biochemiczna, która pozwala na identyfikację i ilościowe określenie białek w próbkach biologicznych. Technika ta opiera się na elektroforezie białek, ich transferze na błonę, a następnie wykrywaniu białek za pomocą przeciwciał specyficznych dla danego białka.

Historia testu Western Blot

Metoda Western Blot została opracowana w latach 70. XX wieku przez naukowców z Uniwersytetu Stanford, George’a Stellę i Harry’ego Towbina. Chcieli oni opracować szybką i precyzyjną metodę analizy białek, która umożliwiłaby identyfikację i ilościowe określenie białek w próbkach biologicznych. Metoda zyskała popularność w latach 80., gdy została użyta do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV.

Zasada działania testu Western Blot

Test Western Blot składa się z kilku etapów:

  1. Elektroforeza białek – Próbka zawierająca białka jest poddawana elektroforezie w żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE). Elektroforeza umożliwia rozdział białek według ich mas cząsteczkowych. Białka o niższej masie cząsteczkowej migrują szybciej niż te o wyższej masie cząsteczkowej.
  2. Transfer białek na błonę – Po zakończeniu elektroforezy białka są przenoszone z żelu na specjalną błonę (najczęściej nitrocelulozową lub PVDF), która jest zdolna do wiązania białek. Proces ten nosi nazwę transferu i może odbywać się na różne sposoby, np. za pomocą prądu elektrycznego (transfer elektroforetyczny) lub przez kapilarność (transfer semi suchy).
  3. Blokowanie błony – Błona z białkami jest następnie poddawana procesowi blokowania, czyli nasycania miejsc, które nie są zajęte przez białka próbki, substancją blokującą. Blokowanie ma na celu zmniejszenie niespecyficznych interakcji przeciwciał z błoną.
  4. Inkubacja z przeciwciałami – Następnie błona jest inkubowana z przeciwciałami pierwotnymi, które są specyficzne dla badanego białka. Przeciwciała pierwotne wiążą się z białkami na błonie, co umożliwia ich detekcję. Po inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi, błona jest poddawana procesowi mycia, aby usunąć niewiązane przeciwciała.
  1. Inkubacja z przeciwciałami wtórnymi – Po usunięciu niewiązanych przeciwciał pierwotnych, błona jest inkubowana z przeciwciałami wtórnymi, które są specyficzne dla przeciwciał pierwotnych. Przeciwciała wtórne są zazwyczaj sprzężone z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa (HRP) lub fosfataza alkaliczna (AP), które umożliwiają wykrycie wiązania przeciwciał wtórnych z przeciwciałami pierwotnymi.
  2. Detekcja – Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi, błona jest poddawana reakcji z substratem enzymatycznym, który po przekształceniu przez enzym sprzężony z przeciwciałami wtórnymi generuje sygnał, taki jak chemiluminescencja (światło) lub zmiana koloru. Sygnał jest następnie detekowany za pomocą odpowiednich urządzeń, takich jak ekspozycja na film fotograficzny, czytnik płyt chemiluminescencyjnych lub systemy obrazowania cyfrowego.

Zastosowania testu Western Blot

Test Western Blot ma szerokie zastosowanie w badaniach naukowych, diagnostyce medycznej i przemyśle biotechnologicznym. Oto niektóre z jego głównych zastosowań:

  1. Identyfikacja białek – Test Western Blot umożliwia identyfikację białek na podstawie ich masy cząsteczkowej i specyficzności przeciwciał pierwotnych.
  2. Ilościowa analiza białek – Technika ta może być stosowana do ilościowego określenia białek w próbkach biologicznych poprzez porównanie sygnałów detekcji z próbką do sygnałów z kalibratorami o znanej koncentracji białka.
  3. Badanie interakcji białek – Test Western Blot może być używany do badania interakcji między białkami, na przykład poprzez sprawdzenie, czy dwa białka są zdolne do wiązania się ze sobą za pomocą przeciwciał specyficznych dla obu białek.
  4. Wykrywanie przeciwciał – Technika ta jest również używana do wykrywania przeciwciał przeciwko białkom, np. w diagnostyce chorób zakaźnych, takich jak HIV czy borelioza.
  5. Badania ekspresji białek – Test Western Blot może być stosowany do badania ekspresji białek w różnych warunkach, na przykład w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne czy zmiany warunków środowiskowych.
  6. Oznaczanie modyfikacji posttranslacyjnych białek – Za pomocą testu Western Blot można badać modyfikacje posttranslacyjne białek, takie jak fosforylacja, glikozylacja czy ubikwitynacja. W tym celu stosuje się przeciwciała specyficzne dla danej modyfikacji.
  7. Kontrola jakości w przemyśle biotechnologicznym – Technika ta jest często stosowana w przemyśle biotechnologicznym do kontroli jakości produktów, takich jak rekombinowane białka, szczepionki czy terapie genowe.

    Ograniczenia testu Western Blot

    Pomimo swojej wszechstronności i szerokiego zastosowania, test Western Blot ma również pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę:

    1. Czułość – Choć test Western Blot jest stosunkowo czułą techniką, może być niewystarczający dla detekcji białek o bardzo niskiej ekspresji lub w próbkach o niskiej koncentracji białka.
    2. Specyficzność przeciwciał – Jakość i specyficzność przeciwciał mają kluczowe znaczenie dla sukcesu testu Western Blot. Niespecyficzne przeciwciała mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wyników lub niewłaściwej identyfikacji białek.
    3. Warianty białek – Test Western Blot może nie być w stanie odróżnić między różnymi wariantami białka, które mają zbliżoną masę cząsteczkową. W takich przypadkach konieczne może być zastosowanie innych technik, takich jak immunoprecypitacja czy spektrometria mas.

    Podsumowując, test Western Blot to potężne narzędzie, które pozwala na identyfikację, ilościowe określenie oraz badanie właściwości białek w próbkach biologicznych. Dzięki swojej wszechstronności i szerokiemu spektrum zastosowań, test ten stał się podstawową techniką w badaniach naukowych, diagnostyce medycznej i przemyśle biotechnologicznym.

    Jednak, aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki za pomocą testu Western Blot, ważne jest przestrzeganie dobrej praktyki laboratoryjnej, właściwego doboru przeciwciał i optymalizacji protokołów.

    Porady i wskazówki dotyczące optymalizacji testu Western Blot

    1. Przygotowanie próbek – Staranne przygotowanie próbek jest kluczowe dla uzyskania dobrych wyników w teście Western Blot. Należy pamiętać o stosowaniu odpowiednich buforów lizujących, inhibitorów proteaz i właściwym utrzymaniu próbek na niskiej temperaturze, aby zminimalizować degradację białek.
    2. Dobór przeciwciał – Staranne sprawdzenie specyficzności i czułości przeciwciał pierwotnych i wtórnych jest niezbędne. Warto przeprowadzić wstępne testy z różnymi przeciwciałami, aby wybrać te, które dają najlepsze wyniki.
    3. Optymalizacja warunków elektroforezy i transferu – Warunki elektroforezy i transferu mają wpływ na rozdzielczość i wydajność przenoszenia białek. Aby uzyskać optymalne wyniki, można dostosować parametry takie jak czas, napięcie czy rodzaj żelu.
    4. Kontrolowanie niespecyficznego wiązania – Aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie przeciwciał, można optymalizować warunki blokowania i mycia. Warto sprawdzić różne roztwory blokujące oraz parametry mycia, takie jak czas, ilość i rodzaj buforu.
    5. Detekcja i analiza wyników – Aby uzyskać najlepsze wyniki, ważne jest dopasowanie detekcji sygnału do właściwego sprzętu i oprogramowania. Dostępne są różne metody detekcji, takie jak chemiluminescencja, fluorescencja czy barwienie kolorem, a każda z nich może wymagać innego podejścia do analizy wyników.

    Czy test western blot trzeba robić na czczo?

    Test Western Blot nie jest testem diagnostycznym, który wymaga od pacjenta bycia na czczo. To technika laboratoryjna stosowana głównie w badaniach naukowych, biologii molekularnej, biochemii czy medycynie, a nie test wykonywany przez pacjentów w celu diagnostyki chorób. Test na czczo jest zwykle wymagany w przypadku badań krwi, takich jak morfologia czy testy biochemiczne.

    Ile czeka się na wynik testu western blot?

    Czas oczekiwania na wynik testu Western Blot zależy od kilku czynników, takich jak rodzaj analizowanego białka, specyfika danego laboratorium oraz ilość próbek do przetestowania.
    Sama procedura Western Blot składa się z kilku etapów, takich jak elektroforeza, transfer białek, inkubacja z przeciwciałami, detekcja sygnału i analiza wyników. W zależności od zastosowanych technik i protokołów, proces ten może trwać od kilku godzin do kilku dni.
    W przypadku badań naukowych, wyniki Western Blot mogą być dostępne w ciągu kilku dni roboczych. Jeśli test Western Blot jest wykorzystywany w diagnostyce medycznej, jak w przypadku testowania na obecność wirusa HIV, czas oczekiwania na wynik może być nieco dłuższy, ponieważ próbki są często wysyłane do laboratoriów referencyjnych, które przeprowadzają analizę.

    Czy test western blot jest refundowany?

    Tak, test może być refundowany przez lekarza NFZ w Polsce.

    Mając na uwadze te wskazówki, test Western Blot może być skutecznie wykorzystany w różnych dziedzinach nauki, medycyny i przemysłu. Jego niezaprzeczalne zalety, takie jak wszechstronność, czułość i możliwość analizy białek o różnych właściwościach, czynią go nieocenionym narzędziem w pracach badawczych i diagnostycznych. Jednakże, aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki, niezbędne jest właściwe przygotowanie próbek, dobór przeciwciał oraz optymalizacja protokołów i warunków eksperymentalnych.

    Dodaj komentarz

    Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *

    Poprzedni artykuł

    Olej MCT czy Oliwa z Oliwek: porównanie i właściwości

    Następny artykuł

    Ciśnienie 140/80 – czy powinienem się martwić?

    Przeczytaj też